O presente estudo objetivou desenvolver um protocolo rápido para a extração de DNA a partir de espermatozoides da espécie ovina. Para isso, ejaculados coletados de um carneiro raça Santa Inês adulto e saudável foram acondicionados e transportados a 5ºC durante 2 horas para serem armazenados a -20ºC e analisados posteriormente. Executaram-se testes de extração de DNA em alíquotas de sêmen contendo 100, 200, 300 e 400 x 106 espermatozoides / mL. Em seguida, a concentração (ng/µL) e pureza (A260/A280) do DNA isolado foram avaliadas em nanoespectrofotômetro. A concentração e pureza de DNA extraído foi superior (P < 0,05) quando a maior concentração espermática (400 x 106) foi utilizada. O protocolo desenvolvido neste estudo foi eficaz para a extração de DNA de espermatozoides ovinos.